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Beaver蛋白纯化磁珠常见问题解答

作者:苏州海狸生物医学工程有限公司 2015-10-21T00:00 (访问量:7406)

 Beaver家族明星产品——蛋白纯化磁珠,一经推出其秉承快速、高效、低成本的优势,获得广大小伙伴的追捧和欢迎。因此小伙伴们也提出了许多问日,小编就几点常见的问题为大家分享。

1.IDA-镍和IDA-钴的区别,应怎么选择?


 

答:IDA-镍的蛋白载量高,40mg/mL gel,获得蛋白纯度稍低90%IDA-钴的蛋白载量稍低,25mg/mL gel获得蛋白质纯度为95%。一般客户建议购买IDA-镍磁珠,即可达到目的。


  2.蛋白纯化时得到的蛋白量少,什么原因?


 

答:1)磁珠用量不足;

  (2)蛋白浓度低;

  (3)蛋白与磁珠亲和力较低;

  (4)磁珠重复使用次数太多,此时应将磁珠进行再生处理。

 

  3. 为什么使用IDA-Ni2+纯化蛋白时,洗脱产物杂带多?


 

答:1)菌体破碎条件太剧烈导致蛋白断裂;

(2)蛋白被部分水解:添加合适的蛋白酶抑制剂,并尽可能在低温下操作;

3)杂蛋白吸附。由于组氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白质中很常见基团,而蛋白折叠可能导致几个这样的氨基酸残基临近,这样也会使它们和磁珠的作用力增加。可以用不同浓度的咪唑进行梯度洗脱,在样品及平衡缓冲液中添加0.5%吐温或TritonX-100,或5~50%的甘油,可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附,或使用钴离子螯合磁珠(BeaverbeadsTMIDA-Cobalt)。

此外,要获得纯度较高的蛋白,需要对裂解、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液的组分、pH、咪唑浓度等进行优化。若还是不能获得高纯度的蛋白,则需要考虑使用多步纯化,结合使用离子交换、凝聚过滤等纯化方法。

 

  4. 目标蛋白已经偶联到磁珠上,但是很难洗脱下来?


 

答:1)洗脱调节太温和。提高洗脱液咪唑浓度至500mM,还不能洗脱时,可以尝试降低洗脱液pH4.0,但低pH会也导致金属离子脱落;

  (2 蛋白吸附在磁珠上无法洗脱。对于非特异性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl浓度至1M,或添加0.1%~2%Triton X-100。对于聚集沉淀在磁珠上的,可以在洗脱缓冲液中加入6M盐酸胍进行变性洗脱。

 

  5. 磁珠再生后,为什么蛋白纯化效果会变差?


 

答:①遇到此情况后,可在再生过程后进行碱处理,可以改善再生磁珠的蛋白纯化效果;

②重新挂金属离子后需要将金属离子清洗干净,必要时可增加洗涤步骤。(残留的金属离子优先跟蛋白结合,影响蛋白与磁珠的结合。)

 

6. IDA磁珠产品中,缓冲液中咪唑添加的意义?



答:结合缓冲液中低浓度的咪唑是为了减少杂蛋白的非特异性吸附;洗涤缓冲液中低浓度咪唑是为了洗脱杂蛋白;洗脱液中高浓度咪唑是为了洗脱目的蛋白。

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