1. 简介
越来越多的证据表明，肿瘤细胞具有高度异质性（Heterogeneity）和可塑性（Plasticity）。肿瘤中的一小群具有无限增殖潜能的、能重建肿瘤发生的细胞被称作肿瘤干细胞（Cancer stem cell），又称肿瘤起始细胞（Tumour initiating cell）。肿瘤干细胞通过自我更新和分化在肿瘤中维持相对稳定的比例。肿瘤干细胞通常处于相对静止的细胞周期，对放疗和化疗药物不敏感，在某些刺激因子作用下重新进入细胞周期从而快速增殖，导致肿瘤的耐药和复发。此外，肿瘤干细胞可通过上皮-间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transtion）和免疫逃逸转移到远端，造成肿瘤转移。
微肿瘤是一种全新的基于患者来源的原代肿瘤细胞体外培养方法（Patient-Derived Tumor-like Cell Clusters，PTC）而建立了肿瘤体外药敏检测模型【1】。微肿瘤 PTC 是由肿瘤干细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等多种细胞组成，能够很好地再现肿瘤组织本身的多细胞微环境与肿瘤上皮细胞的相互作用【2】。
2. 技术方法
2.1肿瘤干细胞的培养方法
目前，肿瘤干细胞的常用培养方法主要包括有非粘附培养、支架培养、三维培养、悬滴培养及生物反应器培养等【3】。
非粘附培养：将肿瘤细胞以单细胞悬浮的形式培养在非粘附的培养皿上，利用无血清或低血清的培养基来促进肿瘤干细胞的形成和增殖。这种方法可以选育单个肿瘤干细胞克隆，并适用于体外测定干细胞特性。
支架培养：将肿瘤细胞种植到三维支架（如纤维素支架、蛋白质支架等）上，提供细胞外基质支持和三维空间结构，模拟体内肿瘤的微环境。这种方法可以促进肿瘤干细胞自我更新和多向分化。
三维培养：将肿瘤细胞种植在三维球体或凝胶中，形成立体结构。这种培养方法能够模拟体内肿瘤组织的结构和功能，提供更逼真的肿瘤微环境。
悬滴培养：将肿瘤细胞以单细胞悬浮的形式滴入培养基中，形成悬滴培养系统。这种方法可以使肿瘤细胞形成球体，提供类似体内的3D环境。
生物反应器培养：利用生物反应器（如旋转式生物反应器、旋转壳层生物反应器等）提供动态环境参数，如流体剪切力、氧浓度、pH值等，模拟体内肿瘤的生物物理特性。
2.2微肿瘤的培养方法【4】
在用于微肿瘤培养前，将肿瘤细胞维持在低吸附的细胞培养瓶中。
为形成微肿瘤，使用含GlutaMAX添加剂和10% FBS、1X非必需氨基酸、100 U/mL青霉素-链霉素以及25 mM HEPES的Gibco DMEM培养基，将细胞以100–5,000个细胞/孔的密度接种到Nunclon Sphera 96孔U形底培养板中（200 μL/孔）。
同时，使用含3%甲基纤维素的完全DMEM培养基将细胞接种到未处理培养板中。将培养板以250 x g离心5分钟。
随后，将细胞置于37°C和5% CO2环境中培养，每72小时换液，即使用多通道移液器从每孔中移除100μL培养基并补充100 μL新鲜培养基。
3. 应用
3.1靶向肿瘤干细胞，推进新药研发
在临床相关性方面，研究已证实，癌症干细胞对化疗和放疗具有天然的耐药性。此外，抑制治疗或微环境诱导的分化的癌细胞（即非癌症干细胞）向癌症干细胞的表型转化被认为是根除肿瘤的关键挑战。来自美国NIH等机构的4位科学家系统汇总了靶向Notch、WNT、Hedgehog和Hippo通路的疗法到目前为止的临床开发进展。同时，文章还讨论了癌症干细胞与免疫系统之间的相互作用，并概述了靶向癌症干细胞的新型免疫疗法【5】。
3.2癌症疫苗的开发
来自美国密歇根大学外科助理教授Qiao Li博士及同事从两类免疫活性的小鼠模式动物中提取肿瘤干细胞，并将其制备成疫苗。实验研究发现接收该肿瘤干细胞疫苗注射的小鼠CTL细胞能够在体外杀死肿瘤干细胞【6】。Xu等的研究发现CSC疫苗能够在接种疫苗的小鼠中显着激发对自体肿瘤抗原的免疫反应,显著抑制了肿瘤生长，延长了存活时间，并减少了晚期卵巢癌 组织中的 CSC 计数【7】。
4.参考文献
【1】Yin S, Xi R, Wu A, Wang S, Li Y, Wang C, Tang L, Xia Y, Yang D, Li J, Ye B, Yu Y, Wang J, Zhang H, Ren F, Zhang Y, Shen D, Wang L, Ying X, Li Z, Bu Z, Ji X, Gao X, Jia Y, Jia Z, Li N, Li Z, Ji JF, Xi JJ. Patient-derived tumor-like cell clusters for drug testing in cancer therapy. Sci Transl Med. 2020 Jun 24;12(549):eaaz1723.
【2】http://oncol.dxy.cn/article/711882
【3】郭德志,张建鹏.肿瘤干细胞培养与分选鉴定的研究进展[J].癌变.畸变.突变, 2023, 35(1):63-66.
【4】https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cell-culture/ cell-culture- learning-center/cell-culture-resource-library/cell-culture-transfection-application-notes/harnessing-new-dimensions-research-coming-round-spheroid-culture.html
【5】Clara JA, Monge C, Yang Y, Takebe N. Targeting signalling pathways and the immune microenvironment of cancer stem cells - a clinical update. Nat Rev Clin Oncol. 2020 Apr;17(4):204-232. doi: 10.1038/s41571-019-0293-2. Epub 2019 Dec 2. PMID: 31792354.
【6】Ning N, Pan Q, Zheng F, Teitz-Tennenbaum S, Egenti M, Yet J, Li M, Ginestier C, Wicha MS, Moyer JS, Prince ME, Xu Y, Zhang XL, Huang S, Chang AE, Li Q. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 2012 Apr 1;72(7):1853-64. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-1400. PMID: 22473314; PMCID: PMC3320735.
【7】Xu H, Zhao F, Wu D, Zhang Y, Bao X, Shi F, Cai Y, Dou J. Eliciting effective tumor immunity against ovarian cancer by cancer stem cell vaccination. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114547. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114547. Epub 2023 Mar 16. PMID: 36933377.