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ELISA试验中阴性的显色和阴性的本底：
以常用的间接法测抗体和夹心法测抗原为例。阳性标本中含有检测系统中特异的抗体或抗原，作为桥梁联结免疫吸附剂和酶结合物，使酶结合物吸附在固相上，无色底物在酶的作用下转变成有色产物，这就是阴性的显色，显色的深度与阳性标本中待测抗体或抗原的量成正比。阴性标本中不含待测的抗体或抗原，酶结合物不能联结在固相上，故不显色。但ELISA是一个复杂的、多步骤的反应过程，反应各步中酶结合物都有可能非特异性的吸附在固相载体上，与底物反应呈现颜色，这就形成了阴性的本底。酶结合物在固相上的非特异吸附通常有以下几条途径。
酶结合物直接吸附在固相载体上。酶结合物是蛋白质，可以直接吸附在固相载体表面。但在ELISA这一步骤中选择了不利于这种吸附的条件，一般说来只要酶结合物工作浓度适当和反应后经过彻底洗涤，可以避免这种吸附。
 酶结合物与固相上包被蛋白质成分起反应。包被抗原不纯时，杂质蛋白也会吸附在固相载体上，某些杂质可与酶标抗体因“错认”而结合。
在间接法中，杂抗原还有可能与血清标本中的免疫球蛋白特异或非特异地结合。另外非特异的免疫球蛋白也可吸附在包被的特异抗原上，特别是这种抗原为碱性蛋白质时，此时酶标记的第二抗体就与吸附的免疫球蛋白反应而形成阴性本底。
在间接法中标本中的非特异免疫球蛋白的含量远远超过特异性抗体，因此可以直接吸附在固相上，这是形成阴性本底的主要原因。聚苯乙烯对免疫球蛋白有很好的吸附性能，IgM的吸附力大于IgG，聚合IgG的吸附力大于单体的IgG。酶标记的抗Ig（二抗）对吸附在载体上的Ig和与固相抗原结合的特异性Ig有着同样的亲和力，因此在加入标本的反应中，虽然采取了不利于吸附的条件，但假设血清标本不作适量的稀释，高浓度的Ig中仍有一些能吸附在固相上，因而产生较高的本底。
在双抗体夹心法中，标本中如含有类风湿因子，也能使阴性血清显色。类风湿因子是作用于多种动物IgG Fc段的自身抗体，多为IgM类，是一种多价抗体。在夹心法检测中充当抗原成分，同时在固相抗体及酶标抗体反应，使酶标抗体结合到载体上。
在ELISA中引入生物素－亲和素系统可以提高检测的灵敏度，但如果使用不当，可使本底加深，反而得不偿失。生物素标记蛋白质如比例不合适，极易形成较高的阴性本底。从蛋清中提取的亲和素是一种碱性糖蛋白，可以通过静电作用吸附在聚苯乙烯上，也是造成BA-ELISA高本底的因素之一。从链球菌中提取的亲和素改善了这一非特异吸附现象。