荷兰奈梅亨市的内梅亨大学医学中心（Radboud University's Medical Center）目前正采用Life Technologies的Ion Torrent PGM开展遗传性乳腺癌筛查测试，其计划于3月向患者提供该项测试。

实验室计划在今年年底前提供PGM癌症突变测试。

上周在佛罗里达州马可岛举行的基因组生物学和技术进步会议上，内梅亨大学中央基因分析实验室的临床分子遗传学家和负责人Marcel Nelen在该会的Ion Torrent用户会议上做了实验室报告，他声称，对于BRCA 1/2测试，其将从Sanger测序转向采用PGM的下一代测序。

荷兰团队与Jose Luis Costa的团队在葡萄牙波尔图大学（IPATIMUP）的分子病理学和免疫学研究所协同合作，共同开展此次测试。

多年来，内梅亨团队一直提供BRCA筛查测试，该测试采用了Sanger测序和多重连接依赖性探针扩增以测量外显子缺失。Nelen表示，其希望设计开发出一种周转时间更快、成本更低的测试。

对于Sanger测试，实验室正在对15800个碱基序列进行分析，包括BRCA 1基因上的5600个碱基和BRCA 2基因上的10300个碱基。“这些基因具有丰富的多态性”， Nelen在报告中说，“突变是分散的，因而不存在热点突变”。

通过采用Sanger测序，实验室每个月对50至60个标本进行分析，周转时间为3至5个星期。“尽管其高效快速，但是成本太高”， Nelen表示，扣除成本，所获利润已经所剩无几。

转向采用PGM测序后，Nelen表示如果能缩减MLPA步骤，其希望能将目前的$3,000标价减少一半或以上，并将周转时间减少至3到5天。

在考虑下一代基因测试时，Nelen说，其目标是希望在内含子-外显子交界区的内含子区域能100%覆盖所有编码外显子以及至少10个碱基（乃至20个）。扩增子应覆盖所有外显子并互相重叠。

实验室目前拥有两台PGM，并设计出了一个订制的AmpliSeq面板，以对BRCA 1和BRCA 2基因进行靶向分析。

经与IPATIMUP协同努力，两个实验室对检测进行验证。最初，各实验室对10个已知标本进行了测试，并对测试结果做了比较。随后，各实验室采用盲法对15个已知标本进行测试，即IPATIMUP实验室对其已知的15个标本进行测试后，发送至内梅亨实验室供其测试，反之亦然。

测试结果表明，共发现65个致病突变，各实验室均未遗漏任一突变，Nelen进一步说明。此类突变包括缺失和插入、基因点突变、外显子缺失以及均聚物延伸突变，Nelen说。

实验室对标本进行了测试，该标本具有已知突变和之前未获知的突变。

Nelen说，其目前正通过OncoNetwork Consortium与大量其他实验室协同合作，致力于采用AmpliSeq技术设计开发癌症面板。

该团队正致力于开发一种适用于PGM的肺癌和结肠癌面板。

除内梅亨大学医学中心外，该团队还包括OncoNetwork Consortium的其他成员，如意大利利阿诺的癌症研究中心、瑞士Viollier制药公司的遗传学和分子生物学部门、英国的华威大学、法国的古斯塔夫-鲁西研究所、法国的巴黎迪卡尔中心大学以及都柏林的圣詹姆斯医院。

内梅亨大学医学中心同样正致力于开展遗传性嗜铬细胞瘤测试。

肺癌和结肠癌面板含有90个扩增子，覆盖22个基因中的热点，需要的DNA总量为10毫微克，可从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取。

六个实验室在OncoNetwork Consortium对155个标本进行测试后，完成了初步验证。

第一阶段：实验室对从FFPE组织中提取的5个对照标本进行测序，其中两个从KRAS细胞株中提取，一个从肺腺癌细胞株中提取，另外两个为异种移植标本。 各实验室分别为所有已知突变命名。

第二阶段：各实验室分别对从肺癌和结肠癌中提取的10个不同标本进行测序，进行测序的实验室了解测序情况，其他小组不了解。各实验室对标本进行测序后，分别将标本互相发送至其他实验室，因此，六个实验室总共对60个标本进行了测序。随后，各实验室分别为所有突变以及野生株和变异株命名。

第三阶段：由于标本的“肿瘤内容存在巨大差异”，这在给变异株命名时出现不少问题，Nelen表示。例如，由于没有足够的DNA，遗漏了一个标本中的突变。 尽管研究人员力图通过Sanger测序对突变进行证实，但“这仍然无法获得正确的序列”。

在第二次验证时，实验室最初对具有已知突变的8个FFPE标本进行了测试，确保该测试能检测出突变。随后，实验室逐渐扩大测试规模，并对共计98个标本进行了测序。

“分子检测应具有可靠的性能、高度的准确性和临床灵敏度，以便能检测出热点突变和功能失活突变，数日内便可获得检测结果”， Nelen解释说。

Nelen还说，实验室将继续对测试（包括引物设计和软件）进行优化和验证。此外，还需在实验室的LIMS系统中实施整个工作流程，Nelen补充说。

“我们的目标是采用截至年底提供的所有癌症面板在3月份开展BRCA1/2测试。 实验室目前正着手进行标本制备自动化和多重PCR测试，并希望能在年底完成。”