PE与抗体的缀合实验方案

注1:整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对 PE 的纯化可能需要24-48小时。除了下面列 出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml   的抗体溶液。请您在进行PE 抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注 2 : SMCC-PE   缀合物非常稳定 (在“交换缓冲液”中，在4C 下至少可以稳定几个月)。因此， 如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 PE,  并将其用于几次抗体实验(在几周内)。 SMCC-PE    的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一  .P E 的 制 备

1.将 PE 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10  mg/ml  。 注意： PE  在缀合前作为 SAS  ( 硫 酸 铵 钠 ) 沉淀物稳定。如果将 PE   以 SAS   沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。

2.使用3 .5毫克R-PE 修饰每毫克lgG, 包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3. 检查 PE 的纯度和浓度，请测量280、565 和 6 2 0 nm 处的吸光度。  (1mg/ml      的 PE  在 565nm   处的 OD  为 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白质。

二 .P E 的 活 化

1.使用前在无水 DMSO   中制备 10  mg/ml 的 SMCC  储备溶液。

2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC, 并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。

3.将纯化的 PE  过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC   相对于 PE   的量，可能会有所好转。

三 . 1gG 还 原

1.在蒸馏水中制备 1 M DTT(15.4mg/100 μl) 的新鲜溶液。

2.1gG  溶液浓度应为 4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、磷酸盐和 TRIS 缓冲液 (pH 范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2 mg/ml,   则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT 浓度可能会有所帮助。

四 .进 行 缀 合

1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩 尔 比 ( 每 IgG 约 2 个 PE)   效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

2.60 分钟后，必须去掉 lgG   上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO 中制备 10 mg  NEM  的新鲜溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl) 。室温下包裹并旋转20 分钟。

2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO  中制备 10 mg  NEM  的新鲜溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。