近年来，随着全球各大药企在新药研发中持续投入，大量新药进入临床阶段，多家国内外的制药企业将更多的资源投入技术研发，致力于实现关键性突破，打造具有差异化的管线。
差异化管线布局关键在于靶点选择，人类蛋白质组中具有药物开发的潜在靶标约有6000多种为膜蛋白。其中结构复杂的多次跨膜蛋白(Multipass transmembrane protein)包括GPCRs、离子通道和转运蛋白等。这些完整结构的多次跨膜蛋白具有重要的功能，从运输到信号转导与诸多疾病的发生紧密相关。在小分子的上市药物中，有超过50%的靶点为多次跨膜蛋白；市面上大部分作用于多次跨膜蛋白的现有药物都有各自的不足，例如同族多次跨膜蛋白中的配体结合口袋相对相似，药物缺乏较好的特异性；亦或是它们参与许多不同的信号通路而产生的不良影响，这些信号通路（离子通道和转运体）可能对整体细胞平衡条件产生强烈影响。这些不足会导致药物安全性堪忧、副作用过强。多次跨膜蛋白靶点相关的疾病需开发针对特定构象或信号通路的治疗方法，获得具有更高亲和力、特异性的药物，单克隆抗体(mAb)靶向多次跨膜蛋白是实现靶向选择的一种有效方法。
在过去生物药研发历程中，多次跨膜靶点大多数被定义为难成药或不可成药的靶点，犹如“高岭之花”触不可及。近年来随着对多次跨膜蛋白认知的逐步深入及技术的迭代更新，更多的靶点开始褪去神秘的面纱，逐渐走入行业的视野。由于存在多个跨膜结构域(TMDs)，这可能导致表达和纯化过程中的不稳定性和聚集，多次跨膜蛋白靶向药物开发最大的挑战在于其构象的复杂程度。对于靶向药物研发而言，获取保持天然构象与活性的靶蛋白是至关重要的环节，因此，迫切需要创新技术来突破多次跨膜蛋白靶点面临的“抗体开发难题”。
图1. 多次跨膜蛋白的经典结构[1]
“抗体开发难题”，我们能做什么？
近岸蛋白自主研发3000+药物靶蛋白，覆盖多个疾病领域，拥有550个物种超过24000个重组蛋白开发经验，产品类型丰富，涵盖多种属、多标签、生物素化以及特定位点突变体蛋白等，应用于动物免疫、抗体药物筛选评估、质量放行等药物研发环节。
在过去的几年内，近岸蛋白对多次跨膜靶点进行深度开发，持续强化，新增了多个多次跨膜靶点产品，公司的多次跨膜蛋白等困难靶点开发技术，解决了跨膜蛋白表达量低、稳定性差、溶解度低及难纯化等难题，产品类型多样，开发技术包含类病毒粒子（VLP）、去垢剂及mRNA等形式。
NovoiSMART®技术平台
NovoiSMART®(Novo Immunize and Screen antibody of Multipass trAnsmembRane proTein）是由近岸蛋白基于丰富的蛋白质和抗体开发经验，针对结构复杂的多次跨膜蛋白抗体开发难的现状，推出的综合性的技术平台，可提供多次跨膜靶点抗体开发整体解决方案。NovoiSMART®技术平台结合多策略抗体发现技术、人源化亲和力成熟等技术，已完成120多个靶标抗体药物候选分子筛选及验证，其中多个候选分子已完成商业转让。NovoiSMART®技术平台能够满足复杂靶点及各类药物开发的不同需求。
案例
一、GPRC5D表位多样性抗体筛选
GPRC5D即G蛋白偶联受体C组5成员D（G protein-coupled receptor, class C, group 5, member D），它是G蛋白偶联受体（GPCRs）家族的成员之一。
图2.GPRC5D结构[2]
GPRC5D在细胞膜表面稳定表达、不会脱落，且在除毛囊以外的正常细胞中不表达，仅在多发性骨髓瘤细胞中显著上升表达。由于MM遗传和表型的异质性，每一种抗原都不是由MM细胞或浆细胞直接表达的，靶点脱落和抗原丢失是引起肿瘤逃逸和MM复发难治的重要原因。靶向GPRC5D的免疫疗法可以抑制肿瘤逃逸，它的表达不受 BCMA丢失的影响，因此使用这种治疗性抗体可以治疗抗BCMA疗法治疗失败或BCMA低表达或不表达的患者。
GPRC5D具有4个胞外结构域（ECD），筛选结合不同抗原结构域和不同抗原表位的抗体并开发成药，可以有效的避免抗原丢失或者突变引起的药效降低或者耐药，增强药物的长期持久性严守MM最后一道治疗防线。近岸蛋白通过NovoiSMART®技术平台，对筛选获得的候选分子进一步进行表位检测。使用GPRC5A的胞外序列对GPRC5D的4个胞外结构域 ECD进行突变替换，并命名1-4（对应图2结构的Loop1-4的替换）。结果如图3和图4显示，成功筛选出表位多样的GPRC5D候选分子。基于此类，对于部分耐药靶标，NovoiSMART®技术平台可以为您提供更优的选择！
图3.流式检测相较野生型的MFI下降比例热图
图4.GPRC5D抗体表位多样性统计
二、CLDN6高特异性抗体筛选
Claudin6 (CLDN6) 是一个四次跨膜蛋白，具有一个短的细胞质N端和一个C端细胞质结构域，两个胞外结构域(ECL1较大，ECL2较小)，以及一个短的胞内环。ECL1和羧基末端的PDZ结合基序( PBM )是CLDNs的典型结构域。
图5.CLDN6结构图[3]
CLDN6和同家族的CLDN9具有高度同源性，其胞外区的氨基酸序列只有三处不同。但二者的表达却并非完全相同，CLDN6在卵巢癌、子宫肉瘤和睾丸癌中高表达，在其它组织中表达极低。同家族的CLDN9在卵巢癌、胆管癌、睾丸癌等癌症中高表达，但在其它组织中也有不同程度的表达。在药物开发中，对家族庞大的靶蛋白来说，不同的适应症涉及不同的靶点设计及药物类型，其所需要的特异性要求也不同。近岸蛋白通过NovoiSMART®技术平台，针对CLDN6和CLDN9分别进行免疫筛选，结果如图6所示，CLDN6候选分子与CLDN6阳性细胞特异性结合，与CLDN9阳性细胞基本无非特异性结合；图7的CLDN9候选分子也显示出与CLDN9阳性细胞的特异性结合，与CLDN6阳性细胞基本无非特异结合。尽管CLDN6和CLDN9序列与结构高度相似，但NovoiSMART®技术平台可以精准筛选出具有高度特异性与功能活性的候选分子。对于诸多家族蛋白众多，且同源性较高的药物靶标开发，NovoiSMART®技术平台可以更快速精准地为您保驾护航！
图6. 抗体特异性结合CLDN6阳性细胞
图7. 抗体特异性结合CLDN9阳性细胞
近岸蛋白已开发多次跨膜靶点（部分）展示
| 靶点名称 | 靶点描述 |
| GPRC5D | GPCR家族，七次跨膜蛋白, 可用于多发性骨髓瘤治疗 |
| Claudin 18.2 | 四次跨膜蛋白，与Claudin 18.1同源性高，可用于胃癌、食道癌、胰腺癌等疾病治疗 |
| Claudin 6 | 四次跨膜蛋白，与Claudin 9同源性高，可用于卵巢癌、子宫内膜癌等多种疾病治疗 |
| NaPi2b | 离子通道蛋白，八次跨膜蛋白，可用于非小细胞肺癌、卵巢癌等疾病治疗 |
| CCR7 | GPCR家族，七次跨膜蛋白, 可用于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等疾病治疗 |
| SCN9A | 离子通道蛋白，二十四次跨膜蛋白，可用于慢性疼痛、神经痛、骨关节炎等疾病治疗 |
参考文献
[1] Gulezian E, Crivello C, Bednenko J, Zafra C, Zhang Y, Colussi P, Hussain S. Membrane protein production and formulation for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 2021 Aug;42(8):657-674. doi: 10.1016/j.tips.2021.05.006. PMID: 34270922.
[2] Rodriguez-Otero P, van de Donk NWCJ, Pillarisetti K, Cornax I, Vishwamitra D, Gray K, Hilder B, Tolbert J, Renaud T, Masterson T, Heuck C, Kane C, Verona R, Moreau P, Bahlis N, Chari A. GPRC5D as a novel target for the treatment of multiple myeloma: a narrative review. Blood Cancer J. 2024 Feb 2;14(1):24. doi: 10.1038/s41408-023-00966-9. Erratum in: Blood Cancer J. 2024 Mar 6;14(1):40. doi: 10.1038/s41408-024-01018-6. PMID: 38307865; PMCID: PMC10837198.
[3] Qu H, Jin Q, Quan C. CLDN6: From Traditional Barrier Function to Emerging Roles in Cancers. Int J Mol Sci. 2021 Dec 14;22(24):13416. doi: 10.3390/ijms222413416. PMID: 34948213; PMCID: PMC8705207.