注： PE 和 APC 的完整操作步骤及标记方案在最后两页，如果不需要看介绍，可直接跳过

藻 红 蛋 白 (R-PE 及 B-PE)

特 点 ：

1.从红藻中纯化

2.具有极高的发射量子产率

3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭

4.高水溶性

 R-PE    与 B-PE    的 区 别 ：

                              Wavelength (nm)                             Wavelerngn (mm)

R-PE   与 B-PE    的 对 比 ：

1.特 点 ：

1.从蓝藻中纯化

2.具有极高的发射量子产率

3.荧光团与蛋白质主链共价结合，不被淬灭

4.高水溶性

APC 和 C-PC  的区别：

APC 和 C-PC 的对比：

交 联 APC    和 APC     的 对 比 ：

1.APC    结构： 它具有α和β亚基，具有明显的(αβ)3 四级结构。

2.为什么要将APC 进 行 交 联 ? 答 ：交联是为了防止APC 在稀释或暴露于变性盐(如尿素或盐酸胍) 时

发生可逆解离，从而保持其结构和功能稳定。

3. 如何进行 APC 交联?

答：通过α和β亚基间的特异性交联可以阻止APC 的分解。

交联比：>1.0

注：图中的红色线条为没有添加NaClO4,   蓝色线条为添加了NaClO4。

如图及表中信息所示， CL-APC  图中添加NaClO4  及没添加NaClO4,   吸收比没有明显变化。而在未交联的APC

中， 添加NaClO4,    得到的吸收比有非常大的变化， 因为APC中加入了NaClO4  导致了它出现了解离。

2.

特 点 ：

1.存在于大多数光合作用的甲藻中

2.高水溶性

3.大斯托克斯位移

光 谱 特 性 ：

优 点 ：

1.高量子产率

2.高水溶性

3.大量结合位点

4.匹配流式细胞仪

5.大斯托克斯位移

6.制备串联染料的良好供体

优 点 ：

1.高量子产率

2.高水溶性

3.大量结合位点

4.匹配流式细胞仪

5.大斯托克斯位移

6.制备串联染料的良好供体

4.

注1:整个缀合过程可以在一天内完成。但是，缀合前对 PE 的纯化可能需要24-48小时。除了下面列 出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml   的抗体溶液。请您在进行PE 抗体缀合实验之前熟悉如

何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注 2 : SMCC-PE   缀合物非常稳定 (在“交换缓冲液”中，在4C 下至少可以稳定几个月)。因此， 如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 PE,  并将其用于几次抗体实验(在

几周内)。 SMCC-PE    的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一  .P E 的 制 备

1.将 PE 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10  mg/ml  。 注意： PE  在缀合前作为 SAS  ( 硫 酸 铵 钠 ) 沉

淀物最稳定。如果将 PE   以 SAS   沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。

2.使用3 .5毫克R-PE 修饰每毫克lgG,    包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3. 检查 PE  的纯度和浓度，请测量280、565 和 6 2 0 nm   处的吸光度。  (1  mg/ml      的 PE  在 565nm   处的 OD  为 8 . 2 ) 。 5 6 5 / 6 2 0 比 率 > 5 0 表示已充分去除污染的藻蓝蛋白；565/280 比 率 > 5 表示已充分去除所有其他蛋白质。

二 .P E 的 活 化

1.使用前在无水 DMSO   中制备 10  mg/ml     的 SMCC  储备溶液。

2.每毫克 PE 加 入 1 1 μlSMCC,    并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。

3.将纯化的 PE  过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC   相对于 PE   的量，可能会有所好转。

三 . 1gG    还 原

1.在蒸馏水中制备 1 M  DTT(15.4       mg/100       μl)  的新鲜溶液。

2.1gG  溶液浓度应为 4 mg/ml   或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、 磷酸盐和 TRIS    缓冲液 (pH     范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2  mg/ml,   则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG    溶液：每毫升 IgG   溶液加入 20μ lDTT      原液并搅拌。室温下静置30

分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含

有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT   浓度可能会有所帮助。

四 .进 行 缀 合

1.每毫克 IgG 添 加 3.2 毫克 SMCC-PE。    用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些

摩 尔 比 ( 每 IgG   约 2 个 PE)   效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮 助。

2.60 分钟后，必须去掉 lgG   上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO   中制备 10 mg  NEM  的新鲜溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl)       。 室温下包裹并旋转20 分钟。

1.

2.60 分钟后，必须去掉 lgG   上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml  干 DMSO  中制备 10  mg  NEM  的新鲜溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl)      。 室温下包裹并旋转20 分钟。

2.

注1:整个缀合过程可以在 一天内完成。但是，缀合前对APC 的纯化可能需要24-48小时。除了下面

列出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml   的抗体溶液。请您在进行APC 抗体缀合实验之前熟悉

如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

注 2 : SMCC-APC    缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4C 下至少可以稳定几个月)。因此，  如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 APC,  并将其用于几次抗体实验(

在几周内)。 SMCC-APC     的长期储存最好是作为饱和硫酸铵沉淀物。

一  .A  PC 的 制 备

1.将 APC  纯化。缀合前的浓度通常为 5-10  mg/ml  。 注意： APC  在缀合前作为 SAS  (硫酸铵钠)

沉淀物最稳定。如果将 APC   以 SAS   沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫 升 1 升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1 升 APC   的 PBS   进行透析2 次。

2.使用1 .7毫克APC 修饰每毫克lgG,    包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

3.检查 APC  的纯度和浓度，请测量280、620和655 nm   处的吸光度。   (1 mg/ml    的 APC  在 655nm   处的 OD  为 5 . 9 ) 。 655/620   比 率 > 1 . 4 表明杂质被充分去除；  655/280    比 率 > 4 表 明所有其他蛋白质均已充分去除

二  .A   PC 的 活 化

1.使用前在无水 DMSO   中制备 10  mg/ml     的 SMCC  储备溶液。

2.每毫克 APC  加 入 6 μlSMCC,    并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。

3.将纯化的 APC  过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少 SMCC   相对于 APC   的量，可能会有所好转。

三 . 1gG    还 原

1.在蒸馏水中制备 1 M  DTT(15.4       mg/100       μl)  的新鲜溶液。

2.1gG  溶液浓度应为 4 mg/ml   或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、 磷酸盐和 TRIS    缓冲液 (pH     范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于 2  mg/ml,   则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

3.用 DTT  配制 20 mMlgG    溶液：每毫升 IgG   溶液加入 20μ lDTT      原液并搅拌。室温下静置30

分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含

有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT  浓度可能会有所帮助。

四 .进 行 缀 合

1.每毫克IgG     添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这 些 摩 尔 比 ( 每 1gG  约 2 个 APC)  效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所 帮助。

2.60 分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml 干 DMSO   中制备 10 mg  NEM  的新鲜溶液。

4.每 毫 克 |gG  添加 34μ g(3.4μl)       。 室温下包裹并旋转20 分钟。

 2.60 分钟后，必须去掉 lgG   上未反应的游离巯基。

3.在 1.0 ml  干 DMSO  中制备 10  mg  NEM  的新鲜溶液。

4.每毫克 |gG 添加 34μ g(3.4μl)      。 室温下包裹并旋转20 分钟。