则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。为得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）PBS溶液润洗样本2-3次，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保持样本湿润。

B. 组织冰冻切片

1）取出冰冻切片，并回温至室温。将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室温下孵育30min。

2）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

3）将玻片浸没在PBS溶液中，室温孵育15min，重复PBS洗一次，共2次。

4）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5）按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/mL。

6）每个样本上滴加100μL浓度为20μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育10min。【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）在盛有PBS溶液的敞口烧杯中润洗样本2-3次。

【注】：为了避免在清洗步骤中的样本脱片损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3次进行清洗。

8）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

C. 细胞爬片的准备

在Lab-Tek载波片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。

D. 细胞涂片的制备（以多聚赖氨酸包被的载玻片为例）

1）以约2×10⁷个细胞/mL的浓度将细胞重悬于PBS中，吸取50-100μL细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液。

2）固定细胞，将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。

3）洗涤载玻片，将其浸入PBS中，室温放置5min。重复用PBS洗一次。

4）轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

5）按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/mL。

6）每个样本上滴加100μL浓度为20μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆盖，室温孵育5min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室温孵育5min进行通透处理）。【注】：Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载波片上脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效率。未得到更好的结果，可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

7）PBS润洗样本2-3次，轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中。

二、DNA酶处理阳性对照的步骤

在样本通透处理后，用DNA酶I处理细胞来准备阳性对照载玻片。该流程通常会引起被处理的大多数细胞显现绿色荧光。

【注】：DNA酶I处理固定的细胞会引起染色体DNA的断裂，产生许多可标记的DNA 3’-末端。

1） 按1:10的比例用去离子水稀释10×DNase I Buffer(每个样本需用200 μL 1×DNase I Buffer，即需要用20μL 10×DNase I Buffer和180 μL去离子水混合稀释)，取其中100μL滴加到已通透的样本上，室温孵育5min。 向剩余100μL 1×DNase I Buffer中加1μL DNase I (1U/μL)，使其终浓度为10U/mL。

2）轻轻叩掉液体，加入100μL含10U/mL DNase I 的缓冲液，室温孵育10min。

3）轻叩载玻片，去掉多余的液体，并将载玻片在装有去离子水的染色缸中彻底洗3-4次。

【注】：阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸，否则阳性对照载玻片上残余的DNase I 可能会在实验载玻片上引入高背景。

三、标记与检测

1）按1:5的比例用去离子水稀释适量5×Equilibration Buffer（每个样品需要100μL 1×Equilibration Buffer）。

2）每个样本滴加100μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30min。或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本。在平衡细胞的同时在冰上解冻Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix，并依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。对于面积小于5cm²的一个标准反应，其体积是50μL，用50μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

表1准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液