6月10日，艾伟拓邀请到多位业内专家，围绕“核酸脂质递送系统稳定性”这一主题，从核酸/脂质递送系统稳定性困境与潜在对策、mRNA关键质量属性、脂质体及LNP冻干工艺开发、脂质递送系统中保护剂应用等不同方面展开介绍与讨论。

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各位专家分享的干货得到了观众的积极反馈，提出了很多有深度的问题。艾伟拓产品团队对问题及答复进行了收集整理，以供各位医药制剂行业的朋友参考。如果您有其他疑问或想法希望进一步讨论，欢迎加入我们的专业讨论群，加群方式详见本文末尾。

此外，对于未能参与本次线上论坛的朋友也请不用着急，艾伟拓已与多位业内专家建立起长期合作关系，会持续推出不同主题的线上/线下产业学术论坛/课程/城市会等活动，始终致力于助力我国高端制剂行业发展。具体活动信息，请关注艾伟拓公司公众号！

以下为线上论坛部分问题及专家答复整理，分为递送系统相关、保护剂相关及冻干工艺相关三部分：

一、脂质递送系统相关问题及答复：

1、载有mRNA的LNP的物理稳定性如何？已上市疫苗是否也有这方面的问题才选用冷冻储存方式？

通过检测内容物渗漏等指标，LNP物理稳定性整体上是比较稳定的。已上市疫苗选择冷冻储存的主要原因不是物理稳定性问题。

2、鱼精蛋白法可以用于沉淀此类脂质载体吗？

理论上或许可行，但做质控或体内实验时，需要考虑效率及沉淀比例问题，比如说做体内实验时，是否能接近100%沉淀？这个是一个需要重点考虑的问题。占昌友老师介绍的抗体法对于脂质载体的沉淀率可以达到99%以上。鱼精蛋白是否可以用于沉淀脂质载体，需要根据沉淀效率等实验数据进行判断。

3、如何解决PEG多次注射产生抗体的问题？

这个是非常好的问题，是新冠疫苗临床产生副作用的潜在原因之一。

解决思路有几点，一个是将PEG的结构与临床产生的免疫反应进行匹配（以进一步明确二者因果关系及作用机理），一个是拉长两次注射的间隔，比如至少相隔3周以上。

需要明确的一点是，对PEG进行改造，即使可能会有所改善，但多多少少还是会对人体产生一定影响。

4、实验室内LNP怎么储存？

用于专门研究温度稳定性的LNP，会储存于不同温度条件下（从冷冻到室温的温度梯度）。

单纯保存用于后续动物实验等目的的LNP，储存于-80℃或者-20℃冰箱。

5、单纯研究脂质递送系统载体性能，从成本考虑，可以推荐模型药物吗？

对于脂质体，推荐使用阿霉素作为模型药物。

对于LNP，荧光蛋白或者Luc是比较常用的，方便检测，前者适合细胞层面的检测，如流式，缺点是活体成像容易受到荧光穿透性能限制，后者活体成像普遍，但是流式没法检测。最终还是要测定目标蛋白表达量，不同的mRNA体内性能一般也不一样。此外，还可以利用DNA的barcode做筛选，这方面可以查文献了解一下详细的实验方案。

6、mRNA拖尾影响翻译效率，这个是加合作用造成的，原理是怎样的？

加合作用指的是LNP中的可电离脂质发生氧化，产生醛基，醛基与mRNA碱基反应发生加合作用，表现为拖尾，该反应会影响mRNA分子的结构及稳定性，进而影响其翻译效率。（具体原理详见艾伟拓公众号近期推文，会进行详细解释。）

7、siRNA或mRNA的装载策略可否多阐述一下？主动载药的动力和包封率如何？

首先，核酸药物的载药不是通过传统的脂质体主动载药方式（如伊立替康脂质体使用蔗糖八硫酸酯钾主动载药或阿霉素脂质体使用硫酸铵主动载药），核酸药物通常是通过微流控体系内流体混合的方式来包封的，油相一般是乙醇溶解的各种脂质，水相是mRNA水溶液，二者通过微流控快速混合实现载药。

包封效率方面，mRNA可以达到80%~90%，siRNA略低一些，核心问题在于储存过程中siRNA由于其相对较小的分子量，泄漏的情况可能会比mRNA更严重一些。相比之下，siRNA药物需要在提升包封率与降低储存期渗漏率方面投入更多考量。

二、保护剂相关问题及答复：

1、脂质递送产品中，糖是如何加入的？工艺是什么样子的？

根据部分已上市脂质体及LNP药物的工艺信息，糖类一般是作为透析液在置换外水相时加入的，通常发生在超滤步骤，部分液体剂型的脂质体，在载药浓缩后也会使用含有糖类保护剂的溶液进行定容。

2、海藻糖加入多少量能够得到较好的LNPs冻干产品？

一般而言，海藻糖的推荐用量低于蔗糖，而蔗糖在脂质体产品中，考虑对粒径及PDI的控制，推荐用量为12%~20%左右，使用海藻糖可以从低于该范围的用量开始尝试，如5%~10%，具体用量需要根据制剂处方开发过程中实验数据决定。

3、冻干工艺参数对脂质体的保护起的作用多大？还是只是保护剂种类更重要？另外，已上市的冻干剂型储存条件是室温么？还是必须还是要2-8度？

冻干工艺参数直接影响的是冻干过程和冻干效果，如一次干燥时间，最终冻干成品含水量等。如果冻干工艺参数设置不合理，一方面会降低冻干效率增加冻干成本，一方面会降低冻干成品质量。保护剂种类也是同理，选择更适宜的冻干保护剂对于提升冻干效率及冻干成品质量均能够发挥作用。二者在开发冻干剂型脂质体制剂中均需纳入考量。

已上市冻干剂型脂质体药物有室温存储的案例也有冷藏存储的案例。

三、冻干工艺相关问题及答复：

1、请问冻干过程中，cake上升和塌陷的原因分别是什么？

蛋糕上升通常容易发生在溶质含量少的冻干样品中，或者冻干机压力波动太大，也容易导致蛋糕上升；讲座中康老师提到的情况，是预冻没冻住，出现的概率还是比较低的。

塌陷的原因是产品温度超过了关键温度。

2、怎么判断脂质体冻干过程中预冻过程是成功的？

共晶点探头插入样品，电阻值达到最大，可以判断为已经完成预冻。

3、在LNP-mRNA冻干过程中有什么特别要注意的？LNP-mRNA冻干与化药脂质体干燥有什么异同？

由于LNP-mRNA的冻干项目目前做的还很少，所以还不能总结一个准确的异同点。目前的经验是，预冻温度需要更低，一次干燥阶段压力需要更低；

4、在小试冻干工艺开发成功后，再放大到中式冻干机以及大规模的过程中，哪些工艺参数需要改变，哪些工艺参数不需要改变？在放大的过程中需要注意什么？

一次干燥时间是一定要重新判断的。如果研发阶段工艺摸索的足够充分的话，只需要改变一次干燥时间，不应该在放大的过程中，再重新摸索和调整板层温度、腔体压力，这两个参数应该在研发过程中就已经充分研究。

5、如何监测产品在冻干过程中的温度变化？板层温度和样品的实际温度是否是一致的？相差多少？

使用产品温度探头实时在冻干过程中检测样品温度，建议选择热电偶探头。

板层温度和样品温度在预冻和二次干燥阶段有一致的时间，一次干燥阶段这两个温度都是不同的，温差为升华热量来源，至于两个温度差多少，不同产品，不同工艺，差的数值都不同。

6、在一次干燥中为什么要变化腔体压力？整个过程中如何是极限真空会有什么影响呢？

一次干燥过程中，不需要变化腔体压力。如果一次干燥阶段一直是极限真空，则冻干时间会比较长，效率比较低，而且极限压力很难控住，这样的工艺稳定性是不足的。

7、在LNP-mRNA冻干时，怎么判断预冻是否成功？在一次干燥，也需要用热电偶温度探头检测其温度吗？还有冻干机自带的温度探头一般放置西林瓶的什么位置，距离瓶底多少mm?

预冻是否成功，用共晶点探头判断，共晶点探头插入样品，电阻值达到最大，可以判断为已经完成预冻。通常用户用热电偶温度探头检测产品温度，如果有升华界面温度软件会更准，但因为这个软件比较贵，配了这个功能的用户比较少。

温度探头顶部放在西林瓶靠近底部又没有接触底部的位置。

8、冻干时，溶液的体积占瓶子的体积最多多少？

一般来说，溶液体积通常不超过瓶子体积的一半。但也有客户几乎装满的，对于这个并没有法规方面的规定，只不过装的越高，工艺时间越长，塌陷的风险越高，工艺越难做。因此具体装入多少溶液进行冻干，需要结合自身设备、工艺及制剂需求进行考量。