本期，我们将围绕缓冲盐这一主题，结合相关研究文献，聊聊冷冻或冻干蛋白制剂中的pH值变化及对应缓冲体系选择的考量。
1. 溶液pH值影响蛋白质稳定性
溶液pH值是蛋白质稳定性的决定因素之一。对于冻干蛋白制剂，其制剂中往往在冻干前就已经添加好缓冲液，以控制①冻干前溶液②冻干过程中冷冻浓缩溶液和③冻干粉复溶溶液的pH值。
同样，需要长时间在冷冻状态下储存的液体蛋白制剂，制剂中通常也会添加缓冲液，以维持冷冻状态及解冻后溶液的pH值。
蛋白类制剂中最常用的缓冲体系包括组氨酸、磷酸盐、柠檬酸盐、氨丁三醇和琥珀酸盐等缓冲盐。
2. 蛋白制剂中缓冲液选择的几点考量
蛋白类药物制剂中缓冲液的选择通常基于所需的pH范围、缓冲能力和缓冲液特异性催化的可能性。理想情况下，在pH值±1单位酸解常数(pKa)时使用缓冲液，pH = pKa时缓冲能力最高。例如，当所需pH为~7.0时，广泛使用磷酸盐缓冲液(pKa ~ 7.2)，而在pH ~ 6.0时，则选择组氨酸(pKa ~ 6.1)作为缓冲液。对于具有多个pKa的缓冲液，如磷酸钠缓冲液(pKas ~ 2.1、7.2和12.3)，有效范围被扩大。
3、冷冻过程中缓冲盐结晶导致pH变化
对于冻干和冷冻制剂处方，在冷冻浓缩过程中缓冲成分的结晶倾向成为一个重要的考虑因素，在冷冻过程中缓冲成分的选择性结晶可能导致pH值的变化，从而影响蛋白质的稳定性。磷酸盐缓冲液是一种被广泛研究的例子，其中十二水磷酸二钠（磷酸盐缓冲液的基本成分）在冷冻过程中降低了冷冻浓缩液的pH值，并可能改变蛋白质的稳定性。
缓冲液的结晶行为和冻结过程中相关的pH值变化取决于几个因素，包括缓冲液的类型和浓度、初始溶液pH和其他配方成分的浓度。
下图显示了不同缓冲液在冻结时的pH值变化，按初始pH值的递增顺序(从左到右)绘制。左图为缓冲液pH偏移＞1单位，右图为缓冲液pH偏移≤1单位。填充的圆圈表示每种缓冲溶液在室温25℃时的初始pH值。箭头指向冻结过程中pH值变化的方向，箭头的尖端表示将溶液冻结至-25℃后的最终pH值。
从图中可以观察到不同因素对缓冲液冻结过程中pH值变化的影响。
（1）初始pH值：柠檬酸盐缓冲液对初始pH为5.0或6.0的溶液效果良好，但当初始pH为4.0时，pH值会发生~+2个单位的变化（浅橘红色，左图第一个柱子及右图两个同色柱子）。同样，组氨酸缓冲液在pH为5.5时显示+2个单位的pH位移，而在pH为6.0和7.0时则没有（深绿色，左图第四个柱子及右图两个同色柱子）。
（2）缓冲液浓度：缓冲液的浓度对pH值变化的幅度和性质都有显著的影响。例如，初始pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，浓度为100 mM时，最终冻结后pH值为2.8，浓度为10 mM时，最终冻结后pH值为4.1（左图最右侧两个柱子）。
（3）与其他溶质的相互作用：制剂处方中的其他溶质和缓冲液组分的相互作用可能会影响彼此的结晶倾向。了解共溶质对缓冲液结晶的影响是很重要的，因为这将影响冷冻浓缩液的pH，从而影响蛋白质的稳定性。
例如，当含有磷酸盐缓冲液(10或100 mM)和甘氨酸(0.8% w/v)的溶液被冷冻时，这两种组分都更易结晶。虽然这并不影响甘氨酸作为冻干赋形剂的功能，但缓冲盐的明显结晶导致冻结时pH值发生变化。
有趣的是，0.8% w/v浓度甘氨酸的存在增加了10mM和100mM磷酸盐缓冲液在冷冻时的pH值变化幅度。而在低浓度(0.4% w/v)下，甘氨酸反而会抑制磷酸盐缓冲液在冷冻时的pH值变化。然而，在如此低的浓度下，甘氨酸可能无法发挥冻干赋形剂的作用。因此，需要明智地选择配方成分及其浓度，以确保各个组分的功能，从而获得稳定的冻干制剂处方。
同样，磷酸盐缓冲液也能抑制甘露醇结晶。下图展示了缓冲液浓度对甘露醇和甘氨酸在最终冷冻产品中结晶情况的影响，溶液中甘露醇和甘氨酸含量为5% w/w。当甘露醇和甘氨酸混合使用时，磷酸盐缓冲盐在冷冻溶液中显著抑制这两种溶质的结晶，磷酸盐缓冲液浓度的增加（50mM~200mM）降低了甘露醇和甘氨酸的结晶度。
甘露醇和甘氨酸的结晶度降低，可以转化为更高的蛋白酶活性保留。下图为冷冻干燥后辅料结晶对乳酸脱氢酶（LDH）活性的影响。上半部分为蛋白酶活性与缓冲液浓度的关系（配方中甘露醇和甘氨酸各占5% w/w），可见随着缓冲液浓度升高，冻干后保留的蛋白酶活性升高。下半部分为最终产品中的结晶甘露醇和甘氨酸馏分。随着缓冲液浓度升高，冻干产物中甘露醇和甘氨酸的结晶度降低。
一般来说，只有无定形的溶质才能抑制缓冲液的结晶。然而，当共溶质结晶时，也观察到缓冲结晶。
4、应对思路
基于上述影响因素分析，在进行制剂处方中缓冲体系的筛选时，明智的做法是使用最低有效浓度的缓冲液。另一种方法是通过配方成分抑制缓冲液结晶，从而减弱任何pH值的变化。非结晶性溶质如海藻糖，蔗糖可抑制缓冲结晶。有时，蛋白质本身可能会抑制缓冲液结晶，从而阻止pH值的变化。
5、小结
本文主要围绕冻干/冷冻状态下缓冲液pH改变对蛋白类制剂（抗体，抗体偶联药物等）稳定性的影响，考虑到缓冲盐结晶导致pH值变化主要与其自身性质有关，与活性成分关系不大，因此相关考量适用于绝大多数pH敏感型的生物制剂，如核酸药物（mRNA-LNP），病毒载体制剂（AAV）等。例如，辉瑞新冠mRNA疫苗上市后制剂处方中缓冲体系由PBS变更为Tris/Tris-HCl，就很可能与磷酸盐缓冲液在极低温度下发生pH值偏移有关。
下一期，艾伟拓产品团队将围绕磷酸盐缓冲液(PBS)在冷冻或冻干状态下pH的变化及应对策略做进一步分析，敬请期待！