派森诺生物助您打造真菌“近完成图”

小编最近吃不好，睡不着，原因是小编遇到了一个头疼的项目。有客户想对20Kb左右的片段进行测序，根据该片段可区分不同的基因型，小编思考后觉得小case。小编根据参考序列将20Kb 的片段分成6段，每段3 Kb左右来设计引物，打算进行PCR扩增后测序拼接。但在扩增中却遇到了问题，我们共设计了4轮引物，依然无法扩增得到部分目的条带，小编的内心受到了一万点伤害。究其原因，是因为客户提供的参考基因组采用短片段的二代测序拼接得到，尽管最终的拼接结果达到了染色体级别，但是碰巧客户想要研究的这一段区域因为结构比较复杂，导致拼接结果千疮百孔，根本没法用。这时，小编在想，如果有一个接近于完成图的基因组那该有多好啊！！

小编相信，我遇到的问题很多老师也遇到过。如果老师您也遇到类似问题，又想从根源上解决这个问题，那么您就来对地方了。小编所在的公司在前期经过大量的文献调研，实验方案设计优化、拼接参数优化，最终总结出一整套方案，采用这套方案，我们拼接得到了一个真正的接近完成图的真菌。今天小编就和大家分享我们完成的两个真菌基因组的成果。

案例一：20M真菌基因组测序

小编要给大家分享的第一个真菌，其基因组大小为20Mb，但客户经费有限，针对该客户的具体情况，我们设计构建三个不同插入片段大小的文库，分别为400 bp、5 kb和10 kb，具体方案见表一：

表一 20 M真菌基因组方案

对二代短插入片段的测序数据进行 17-mer 分析，结果见图1，从这个图上可以看到这个基因组相对比较复杂，K-mer出现3 个峰，我们估算这个基因组大小为 28 M，见表二：

表二 17-mer分析结果统计

图 1. 17-mer深度分布图

结合第二代和第三代测序的结果进行拼接，共得到140条 Contig，结果见表三，最长 Contig 的长度高达1.28 Mb，Contig N50 长度为570 Kb左右，而采用纯二代拼接得到的contig N50 为 117 kb，即Contig N50 提升了 4.87倍。

表三 20 M真菌基因组拼装的数据统计

案例二：30M真菌基因组测序

小编要和大家分享的第二个真菌，其基因组大小为 30 Mb。根据之前的项目经验，结合客户的实际情况，我们设计构建了两个不同插入片段大小的文库，分别为400 bp、20 kb，具体方案见表四：

表四 30 M 真菌基因组方案

对测序数据进行拼接组装，其结果给了我们很大惊喜，我们总共拼接得到12个contig序列，其中11条为染色体序列，1条为完整的线粒体序列。由于，客户未对该真菌进行核型分析，我们无法判断这个基因组包含多少条染色体，但是根据经验以及拼接的效果，我们有理由相信，这个真菌拼接到了近“完成图”的效果。

表五 30M真菌基因组拼装结果统计

图2 基因组圈图 图3 线粒体圈图

小结：

采用三代测序进行真菌基因组测序说难不难，说易不易。只有把每一个步骤做好，做扎实了，才能得到比较好的结果。小编的同事们从以下四个方面进行优化：

l 从实验设计方面，我们会根据您的基因组大小、基因组复杂程度以及GC含量为您私人定制最合适的实验方案；

l 在样品提取方面，我们独家研制出了针对不同菌种的提取方法，且已申请**。和目前市面上的试剂盒提取方法相比，该提取方法获得的DNA 在完整度、纯度方面更胜一筹；

l 在建库方面，我们拥有Blue Pippin 全自动核酸片段回收系统可高效率自动化回收大片段，去除小片段DNA，确保得到超长片段的DNA，有利于后续的拼接分析；

l 在信息分析方面，我们采用多种算法进行混合拼接。

上述第一个方案三代测序构建的文库插入片段长度为10 Kb，第二个方案插入片段长度为20 kb，从拼接效果来看，第二个方案的效果要显著好于第一个方案，可拼接得到近“完成图”的效果，因此在真菌基因组测序时小编更推荐大家采用20Kb的文库。我们公司目前正在同时做好几个 50 M左右的真菌的测序，一旦有结果，我们就会把我们的经验和大家做一个分享，而且我们也准备迎接接下来的挑战，在大型动植物基因组中构建长片段文库进行测序，也希望大家随时关注我们，和我们一起合作，打造属于老师您的完美基因组。